土壤中戴奧辛篩檢方法-化學活化冷光酵素基因表現法

一、   採樣與保存
(一)              土壤可參考本署公告「土壤採樣方法」及「底泥採樣方法」等相關採樣方法採樣(註1)。採得之樣品裝入瓶蓋附鐵氟龍墊片之玻璃瓶內,避光保存在10℃下運送至實驗室。
(二)              雖無數據證明最長之樣品保存期限,土壤樣品如經乾燥、研磨、過篩後存於室溫暗處,則保存期限可達一年以上。
二、   步驟:
(一)              樣品預處理:請參考本署公告之NIEA M801方法規定。
(二)              樣品萃取:稱取 2 至10 g樣品進行萃取,可使用索氏萃取、高壓溶劑萃取、超音波萃取、震盪萃取等方式進行(註2)。
(三)              樣品淨化及分離:可使用酸性矽膠管柱及活性碳管柱進行樣品淨化及分離。完成淨化之樣品,須將溶劑完全置換為DMSO(建議體積為50μL),即為樣品萃取液。
(四)              重組細胞株之培養與維持
1.     細胞培養:
(1)         一般將細胞置於含有胎牛血清之細胞培養液的培養瓶內進行培養,細胞培養箱之溫度為37℃(二氧化碳 5%、溼度 100%)。
(2)         當細胞密度過高(註3),須進行繼代培養。先將細胞培養液吸除,以磷酸緩衝鹽溶液沖洗,再使用胰蛋白酵素於37℃作用使細胞脫落懸浮後,取適量細胞加入新鮮之細胞培養液,換一新培養瓶繼續培養。
2.     細胞儲存:須將細胞培養液置換為內含抗凍劑(如DMSO)之冷凍用培養液,分裝至細胞冷凍小管,逐步降溫後再放入液態氮中長期儲存。
3.     細胞解凍:冷凍保存之細胞,解凍時須置於37℃水浴槽儘速回溫,再將冷凍用培養液置換為含有胎牛血清之細胞培養液。
(五)              戴奧辛檢測
1.     細胞植入96孔盤:
(1)         先評估檢測樣品所需之96孔盤總數及所需之細胞總量。
(2)         將所需之細胞以胰蛋白酵素處理使其脫落懸浮後,以細胞培養液稀釋至適當濃度,再以八爪微量吸管或可調式連續分注吸管分裝至96孔盤。
(3)         將完成細胞植入程序的96孔盤移入二氧化碳培養箱,在37℃下培養約 24 小時後,如細胞生長良好,即可進行暴露實驗。
2.     細胞暴露:
(1)         製備2,3,7,8-TCDD檢量線:以DMSO為溶劑製備檢量線,檢量線至少應有7個不同濃度,濃度之分布應趨近於等比數列。檢量線最低點應高於偵測極限(註4),中間點應落於 50% 有效濃度(the median effective concentration, EC50)附近,最高點所測得之冷光強度應接近該檢量線之反應極限值(註5)。
(2)         製備暴露培養液(註6):
A.   2,3,7,8-TCDD檢量線:將檢量線樣品分別取定量加入細胞培養液中並均勻混合,DMSO最終濃度須小於 1%(v/v)。
B.    待測樣品萃取液:以DMSO適度稀釋後(註7),分別取定量加入細胞培養液中並均勻混合,DMSO最終濃度須小於 1%(v/v)。
C.   DMSO試劑空白:取定量DMSO加入細胞培養液中並均勻混合,DMSO最終濃度須小於 1%(v/v)。
(3)         進行96孔盤暴露實驗:將培養約 24 小時之96孔盤由細胞培養箱取出後,將暴露培養液沿孔壁加入,完成後再將96孔盤放回細胞培養箱,暴露約 24 小時。
3.     細胞溶解及冷光測定:
(1)         完成暴露程序後,將96孔盤由細胞培養箱取出進行鏡檢,確認細胞是否狀態良好,沒有遭受毒害或細菌污染之狀況(註8)。
(2)         將96孔盤內之暴露培養液吸除,再以磷酸緩衝鹽溶液潤洗。
(3)         每孔注入適量之細胞溶解液,震盪使細胞溶解後再進行冷光測定。
(4)         以冷光儀自動注入冷光酵素受質溶液,與冷光酵素作用後測定冷光強度(以Relative Light Units(RLU)表示)。
一、   結果處理
每一96孔盤之冷光強度測定結果,均須先扣除該盤之冷光背景值(DMSO試劑空白之冷光平均值)後,再進行下列資料分析:
(一)              2,3,7,8-TCDD檢量線計算(註5)
1.     將檢量線以冷光強度對標準品濃度之對數值作圖,結果曲線應呈現S形(Sigmoid shape,如圖一)。
2.     冷光強度與標準品濃度之關係,應符合下列之希爾方程式(Hill equation):
y = 經背景校正之冷光強度值(RLU)
x = 2,3,7,8-TCDD 之濃度值
a0 = 反應極限值
a1 = 50%有效濃度
a2 = 曲線的形狀參數
依據最小平方最適迴歸法則(Least-squares best-fit),利用統計軟體(註9)找出最符合標準品測定值之曲線,即可得到a0a1a2
(二)              暴露培養液中類戴奧辛物質之總毒性當量濃度估算:求出與樣品同一96孔盤上之檢量線的a0a1a2後,再將樣品之冷光強度值(y)代入上述公式計算出x值,即為暴露培養液中類戴奧辛物質之總毒性當量濃度。
(三)              樣品之總毒性當量濃度估算:若計算出之x值單位為pM,代入下列公式即可求得樣品之總毒性當量濃度,單位為ng CALUX-TEQ/kg:
二、   品質管制
(一)              依本方法執行戴奧辛檢測之實驗室,須建立最初分析之起始精密度與回收率資料(註10)。
(二)              依本方法執行戴奧辛檢測時,須進行之品管分析包括方法空白樣品分析、重複樣品分析、查核樣品分析。
1.     每10個樣品應執行上述之品管分析各1個;若每批次樣品數少於10個,則每批次仍應執行上述之品管樣品分析各1個。
2.     查核樣品應以2,3,7,8-TCDD配製,其濃度約50 ng/kg。
(三)              為克服樣品基質干擾及有效率執行本方法之檢測,檢驗人員可適當變更第七節之步驟程序,惟檢測結果之數據品質不能低於本方法之品管規範。變更之檢測方法,實驗室必須保留相關之檢測品保品管數據資料,編頁碼裝訂成冊,包括:
(1)         執行方法變更之原因說明。
(2)         執行方法變更後之檢測品管數據資料,含:
A.   起始精密度與回收率資料。
B.    空白分析。
C.   準確度評估。
(四)              進行七、(五)(2)細胞暴露時,每一96孔盤均須伴隨進行下列檢測,並符合下列品管要求:
1.     2,3,7,8-TCDD檢量線:每一濃度至少進行二重複。以平均值進行檢量線計算,檢量線之r2 應大於或等於 0.98。
2.     DMSO試劑空白:至少進行三重複,以平均值作為該盤之冷光背景值。
3.     檢量線查核樣品:應進行三重複,三重複之相對標準偏差應小於 15%。查核樣品之相對誤差值宜在 ± 15% 以內。
4.     待測樣品:各稀釋度樣品皆應進行三重複。最後用於總毒性當量估算之稀釋度,檢測結果應符合下列要求:
(1)         三重複之相對標準偏差應小於 15%。
(2)         冷光讀值應落於檢量線EC50附近之線性部分(註5)。
三、   精密度與準確度
略。
四、   參考文獻
(一)              US EPA, Method for Toxic Equivalents (TEQs) Determinations for Dioxin-Like Chemical Activity with the CALUX® Bioassay, SW-846 Method 4435, 2008.
(二)              US EPA, Screening Extracts of Environmental Samples for Planar Organic Compounds (PAHs, PCBs, PCDDs/PCDFs) by a Reporter Gene on a Human Cell Line, SW-846 Method 4425, 2007.
(三)              BioDetection Systems BV, Standard Operation Protocols for DR CALUX® Bioassay.
註1:本文引用之公告方法名稱,以行政院環境保護署最新公告者為準。
註2:須注意使用之溶劑是否會對細胞產生毒性或是造成偽陽性反應。
註3:細胞培養時,其緻密度(Confluence)不宜超過 90%。
註4:每一96孔盤偵測極限之計算方式為該盤DMSO試劑空白三重複之標準偏差的 2.5 倍,單位為RLU。再代入檢量線方程式,即可算出暴露培養液中TEQ濃度之偵測極限。
本所98年度進行 12 盤檢測,暴露培養液中TEQ濃度之平均偵測極限為 0.17 pM(分布範圍為 0.04 至 0.31 pM)。
註5:若因細胞株特性,檢量線無法呈現S形並符合希爾方程式,實驗室應提出適用之檢量線計算方式,並符合第九節所述品質管制規範。
註6:進行細胞暴露實驗時,同一96孔盤之暴露培養液,須有相同之DMSO最終濃度。一般進行暴露實驗之DMSO最終濃度不超過1%,濃度過高會造成細胞毒性。
註7:為避免可能之干擾物質造成偽陽性結果,樣品萃取液至少應進行1:10、1:100、1:1000等 3 個稀釋度的暴露實驗。
註8:若遭受毒害或細菌污染,會造成偽陰性之結果。因此檢測時於暴露程序完成後,應於顯微鏡下觀察細胞狀態是否良好。若細胞有遭到毒害之現象(細胞貼附狀況不佳或者細胞型態有顯著變化),應將樣品稀釋或重新淨化,去除具細胞毒性的雜質後再行檢測。
註9:如Excel之規劃求解功能。
註10:執行四重複之查核樣品分析。
圖一、2,3,7,8-TCDD標準曲線
Author: admin on 2013 年 01 月 21 日
Category: 土壤
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