預告訂定「土壤中戴奧辛篩檢方法-化學活化螢光酵素基因表現法(NIEA S901.60B)」草案 « 環保法律公告資訊

預告訂定「土壤中戴奧辛篩檢方法-化學活化螢光酵素基因表現法(NIEA S901.60B)」草案

一、   方法概要
本方法使用特殊之重組細胞株,進行土壤中類戴奧辛化合物之總毒性當量(Toxic Equivalents, TEQ)測定。此類細胞株已穩定轉殖具有戴奧辛反應元素(Dioxin Responsive Element, DRE)及冷光酵素(Luciferase)基因之質體,培養過程中若接觸戴奧辛/呋喃及其他類戴奧辛化合物(Dioxin-like chemicals),這些化合物會和細胞內的多環芳香烴接受體(Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR)結合後形成複合物,接著進入到細胞核內與DRE基因結合,促使DRE下游的基因進行轉錄與轉譯,同時誘發冷光酵素之產生,且酵素產量呈現劑量效應關係。此種技術稱之為化學活化冷光酵素基因表現法(Chemical-Activated LUciferase eXpression, CALUX)。
檢測時,樣品經萃取、濃縮、淨化等程序後,添加至細胞中暴露24小時,溶解細胞釋出冷光酵素,同時添加冷光素使其受冷光酵素催化發出冷光。因冷光與戴奧辛類化合物之間有劑量效應,藉由測定樣品之冷光強度與 2,3,7,8-TCDD 標準曲線所產生之冷光強度進行比對,即可估算樣品中類戴奧辛化合物之總毒性當量。如欲分別估算樣品中戴奧辛/呋喃及毒性多氯聯苯之毒性當量,可於淨化時利用活性碳管柱將二類化合物分開,再分別進行暴露實驗。
二、   適用範圍
(一)              本方法適用於測定土壤、底泥及淤泥樣品中類戴奧辛化合物之總毒性當量。
(二)              本方法之檢測人員應受過有機分析技術及細胞培養技術之訓練。每一實驗室在使用本方法時皆須遵行第九節所述品質管制規範,以證明其具有能力產生可接受之檢測報告。
三、   干擾
(一)              測定時,若樣品中存在其他可活化多環芳香烴受體之物質(如多環芳香族化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)及其他結構類似之化合物),可能造成檢驗結果偏高之干擾。
(二)              樣品萃液中若有具細胞毒性的雜質,可能會導致偽陰性之結果。
四、   設備及材料
(一)              廣口玻璃瓶(Wide mouth glass bottles):褐色,容量125 mL或其他適當大小,附螺旋蓋鐵氟龍內墊。
(二)              天平(Balance)
1.     精密天平:可精稱至 0.1 mg。
2.     電子天平:可精稱至 10 mg。
(三)              吹氮濃縮裝置(Termovap sample concentrator)。
(四)              烘箱(Oven):溫度可達200℃。
(五)              洗瓶(Wash bottles):鐵氟龍材質,500 mL。
(六)              玻璃樣品瓶(Glass test tube):1.8 mL、22 mL(6 dram)或其他適當大小,附螺旋蓋鐵氟龍內墊。
(七)              丟棄式玻璃滴管(Pasteur pipettes):9 英吋長。
(八)              矽膠帽(Pipette bulbs):1 至 2 mL。
(九)              玻璃棉(Glass wool):使用前依序以二氯甲烷及正己烷浸泡淋洗,以氮氣吹乾後置於褐色瓶內備用,亦可使用市售清洗過之玻璃棉。
(十)              藥勺(Sampler spoons):不銹鋼材質,或同級品。
(十一)    玻璃漏斗(Glass funnels):125 mL、250 mL。
(十二)    乾燥器(Desiccator)。
(十三)    重組細胞株:已穩定轉殖具有戴奧辛反應元素及冷光酵素基因之質體。
(十四)    Class II 生物安全櫃(Class II biological safety hood)。
(十五)    高壓滅菌釜(Autoclave):溫度能保持在 121℃(壓力約 15 lb/in2 或 1.1 kg/cm2)滅菌 15 分鐘以上。
(十六)    細胞培養箱(Water jacketed cell culture incubator):水匣加熱式,可將溫度維持在37℃、二氧化碳濃度維持在 5%。
(十七)    循環式水浴槽(Circulating water bath):溫度能保持在約37℃。
(十八)    倒立式顯微鏡(Inverted microscope):具 40 倍及 100 倍放大倍率。
(十九)    –70℃冷凍櫃(–70℃freezer)或液態氮樣品儲存桶(Liquid nitrogen dewar)。
(二十)    96孔盤震盪器(Shaker for 96 well plates):轉速可維持在每分鐘約 300 至 450 轉。
(二十一)          冷光儀(Luminometer):可用於96孔盤之冷光檢測,至少須具有一個試劑分注器。
(二十二)          試管震盪器(Vortex)。
(二十三)          吸管輔助器(Pipetting aid)。
(二十四)          無菌吸管(Sterile pipettes):玻璃或塑膠材質,體積為5、10、25 mL。
(二十五)          可調式微量吸管(Adjustable micropipette):2 至 20μL、20 至 200μL、100 至 1000μL 或其他適當大小。
(二十六)          可調式八爪微量吸管(Adjustable 8-channel micropipette):5至 50μL 或其他適當大小。
(二十七)          可調式連續分注吸管(Repeater pipette)。
(二十八)          細胞培養瓶(Tissue culture flask):75 平方公分或其他適當大小。
(二十九)          96孔細胞培養盤(96 well cell culture plates)。
(三十)    細胞冷凍小管(Cryogenic vials):2 mL,塑膠材質,無菌。
五、   試劑
(一)              正己烷(Normal hexane):殘量級。
(二)              甲苯(Toluene):殘量級。
(三)              甲醇(Methanol):殘量級。
(四)              丙酮(Acetone):殘量級。
(五)              二氯甲烷(Methylene chloride):殘量級。
(六)              試劑水(Reagent water):不含有機物質之去離子水。
(七)              硫酸(Sulfuric acid):試藥級。
(八)              矽藻土(Celite):545-AW(Supelco 2-0199),或同級品。
(九)              活性碳(Activated carbon):Carbopak C,Supelco 1-0258,AX-21,或同級品。
(十)              矽膠(Silica gel):Fisher 100-200 mesh,或同級品。
(十一)    無水硫酸鈉(Sodium sulfate, anhydrous):粒狀,試藥級。
(十二)    DMSO(Dimethyl sulfoxide):Sigma-Aldrich 270431,或同級品。
(十三)    磷酸緩衝鹽溶液(Phosphate buffered saline; PBS):VWR 45000-446,或同級品。
(十四)    胰蛋白酵素(Trypsin):Sigma T4424,或同級品。
(十五)    胎牛血清(Fetal calf serum):Gibco 26140-079,或同級品。
(十六)    細胞培養液(Cell culture media):RPMI 1640培養液,α-MEM培養液,或其他可供細胞生長之培養液。
(十七)    細胞溶解液(Cell culture lysis reagent):Promega E1531,或同級品。
(十八)    冷光酵素受質溶液(Luciferase substrate solution):Promega E1501,或同級品。
(十九)    酒精(Ethanol):濃度介於70%至75%。
(二十)    氫氧化鈉(Sodium hydroxide):試藥級。
(二十一)          氮氣(Nitrogen gas):純度99.99%以上。
(二十二)          2,3,7,8-TCDD標準品。
Author: admin on 2013 年 01 月 21 日
Category: 土壤
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